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微生物所在CRISPR適應(yīng)機(jī)制方面取得系列進(jìn)展

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微生物所在CRISPR適應(yīng)機(jī)制方面取得系列進(jìn)展

摘要: 　　CRISPRs-Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的適應(yīng)性核酸免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有豐富多樣的功能組分和核酸處理機(jī)制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）和基因檢測技術(shù)（如CRISPR-C2c2/Ca ...

　　CRISPRs-Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的適應(yīng)性核酸免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有豐富多樣的功能組分和核酸處理機(jī)制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）和基因檢測技術(shù)（如CRISPR-C2c2/Cas13a系統(tǒng)），同時(shí)也為理解生命的進(jìn)化與適應(yīng)機(jī)制提供了前沿窗口。中國科學(xué)院微生物學(xué)習(xí)所微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室向華學(xué)習(xí)組是我國較早從事CRISPR-Cas系統(tǒng)基礎(chǔ)學(xué)習(xí)的團(tuán)隊(duì)，面對國際上長期不足CRISPR從純病毒高效獲取spacer的適應(yīng)系統(tǒng)的困境，于2014年在古菌中建立了首個(gè)（所有系統(tǒng)中第二個(gè)）CRISPR-Cas系統(tǒng)對純病毒的高效適應(yīng)體系，揭示了嗜鹽古菌I-B型CRISPR高效適應(yīng)需要“引發(fā)”的本質(zhì)，首次提出了引發(fā)適應(yīng)可能是CRISPR系統(tǒng)在自然界對病毒發(fā)生高效適應(yīng)的主要模式這一重要論斷；并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)除高效性外，引發(fā)適應(yīng)還通過巧妙的PAM驗(yàn)證實(shí)現(xiàn)了嚴(yán)格的異己區(qū)分和高效的防病毒逃逸機(jī)制，回答了困擾科學(xué)家多年的CRISPR適應(yīng)過程的高效性及異己區(qū)分難題（Nucleic Acids Res.， 2014，42：2483–2492；Nucleic Acids Res.， 2014，42：7226–7235）。相關(guān)工作作為CRISPR適應(yīng)領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)已被Nature， Cell， Science， PNAS 等引用80余次。最近，向華學(xué)習(xí)組通過對該CRISPR系統(tǒng)的人工改建，又在CRISPR適應(yīng)過程中spacer的長度決定和定點(diǎn)整合的位點(diǎn)識別機(jī)制方面連續(xù)取得了新的進(jìn)展（Nucleic Acids Res.， 2016，44：4266–4277；Nucleic Acids Res.， 2017，45 : 4642-4654）。
　　CRISPR適應(yīng)過程中，spacer整合反應(yīng)往往發(fā)生于CRISPR結(jié)構(gòu)的leader端且與其緊鄰的repeat將發(fā)生精確復(fù)制。長期以來，國際上普遍認(rèn)為整合復(fù)合物先識別repeat的一端，再通過嚴(yán)格的分子尺機(jī)制識別另一端，從而確定新復(fù)制repeat的尺寸和序列。但有意思的是，多個(gè)學(xué)習(xí)團(tuán)隊(duì)傾向于先識別序列保守的“repeat近leader”端，而另外有實(shí)驗(yàn)室則認(rèn)為是先識別“repeat遠(yuǎn)leader”端。向華學(xué)習(xí)組巧妙設(shè)計(jì)了一個(gè)引發(fā)-整合相分離的CRISPR高效適應(yīng)系統(tǒng)，通過系統(tǒng)的掃描突變鑒定了repeat內(nèi)部兩個(gè)關(guān)鍵的整合識別元件。其中，元件1（AACCC）嚴(yán)格位于“近leader”端整合位點(diǎn)的下游10 bp處，而“遠(yuǎn)leader”端整合反應(yīng)嚴(yán)格地發(fā)生于元件2（GTGGG）下游約10 bp處。上述兩元件為repeat識別所必需，且其間距的增減可在一定范圍內(nèi)相應(yīng)增減repeat的固有尺寸，這說明在spacer整合過程中并不存在repeat長度的分子尺機(jī)制，而是整合復(fù)合物先識別近leader的repeat的內(nèi)部關(guān)鍵元件，并通過10-bp左右的分子尺識別兩端的整合反應(yīng)位點(diǎn)（Nucleic Acids Res.， 2016，44：4266–4277）。有意思的是，這一重要發(fā)現(xiàn)發(fā)表不久，很快得到了國際上其他團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，說明了該機(jī)制在不同CRISPR系統(tǒng)中具有普遍性。
　　關(guān)于spacer長度決定機(jī)制，2016年國際上兩家重要實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)解析了大腸桿菌spacer獲取機(jī)器（Cas1-Cas2復(fù)合物）在底物結(jié)合狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性限制提供了一個(gè)固定的分子尺，并界定了spacer的長度。但令人費(fèi)解的是，在其它大多數(shù)的CRISPR系統(tǒng)中，spacer長度并非固定不變，而是具有一定的尺寸多態(tài)性。向華學(xué)習(xí)組進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一個(gè)CRISPR單一引發(fā)的適應(yīng)系統(tǒng)，利用高通量測序技術(shù)，分析了近4萬個(gè)新spacer的獲取過程，發(fā)現(xiàn)與自然界已有的數(shù)據(jù)一樣，這些spacer的尺寸并非固定不變，而是在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)正態(tài)分布。有意思的是，他們通過生物信息學(xué)分析檢測到在spacer倒數(shù)第三個(gè)堿基位點(diǎn)上的胞嘧啶（C）偏好性，對相應(yīng)位點(diǎn)的突變則可改變獲取spacer的尺寸。該高通量數(shù)據(jù)結(jié)合分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，首次發(fā)現(xiàn)spacer獲取機(jī)器不僅識別protospacer 5’一側(cè)的PAM序列，而且識別protospacer 3’端的局部序列，這一序列特異性識別可對獲取機(jī)器的分子尺機(jī)制進(jìn)行微調(diào)，從而導(dǎo)致了spacer尺寸的多態(tài)性。該spacer獲取的大數(shù)據(jù)分析工作，還觀測到了適應(yīng)機(jī)器在病毒模板上的滑脫（slip）和在整合過程中的翻轉(zhuǎn)（flip）現(xiàn)象，并進(jìn)一步證明了引發(fā)適應(yīng)過程中雙向?qū)とpacer的滑動（sliding）假說（Nucleic Acids Res.， 2017，45 : 4642-4654）。
　　上述最新進(jìn)展為系統(tǒng)理解CRISPR引發(fā)適應(yīng)過程（靶向引發(fā)，雙向?qū)と。c(diǎn)整合）的高效性與特異性提供了新的依據(jù)（圖1），也為未來開發(fā)基于CRISPR精妙的適應(yīng)過程的分子生物學(xué)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。向華團(tuán)隊(duì)的李明和龔路遙是Nucleic Acids Res.， 2017，45 : 4642-4654的并列第一作者；王銳和李明是Nucleic Acids Res.， 2016，44: 4266–4277的并列第一作者；向華是上述論文的唯一通訊作者。相關(guān)學(xué)習(xí)得到了國家自然科學(xué)基金（面上項(xiàng)目）的資助。



　　引發(fā)適應(yīng)過程中spacer的尋取和定點(diǎn)整合機(jī)制示意圖

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