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上海生科院等設(shè)計(jì)出高效精確基因靶向整合的新策略

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上海生科院等設(shè)計(jì)出高效精確基因靶向整合的新策略

摘要: 　　5月19日，細(xì)胞學(xué)習(xí)期刊在線發(fā)表了題為運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)以同源臂介導(dǎo)的末端接合為基礎(chǔ)的靶向整合的學(xué)習(xí)論文，該學(xué)習(xí)由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)習(xí)院神經(jīng)科學(xué)學(xué)習(xí)所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝學(xué) ...

　　5月19日，細(xì)胞學(xué)習(xí)期刊在線發(fā)表了題為運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)以同源臂介導(dǎo)的末端接合為基礎(chǔ)的靶向整合的學(xué)習(xí)論文，該學(xué)習(xí)由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)習(xí)院神經(jīng)科學(xué)學(xué)習(xí)所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝學(xué)習(xí)組、基因編輯平臺(tái)施霖宇團(tuán)隊(duì)與蘇州非人靈長(zhǎng)類學(xué)習(xí)平臺(tái)孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作完成。該學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)了一種以同源臂介導(dǎo)的末端接合（Homology-Mediated End Joining， HMEJ）為基礎(chǔ)的基因敲入策略，它在很多種系統(tǒng)（體外培養(yǎng)的細(xì)胞、動(dòng)物胚胎和體內(nèi)組織）中比現(xiàn)有的基因敲入策略的效率都要高�；诟咝У木庉嬓屎透玫木_度，HMEJ介導(dǎo)的基因敲入方法為一系列應(yīng)用，包括基因編輯動(dòng)物模型的建立、疾病的靶向基因治療等提供了非常大的應(yīng)用前景。
　　在臨床治療應(yīng)用方面，精確的靶向基因組編輯是非常重要的。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白-9核酸酶（Cas9）系統(tǒng)通過在基因組上靶向形成DNA雙鏈斷裂（DSB）的方式極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因的靶向整合。一旦產(chǎn)生一個(gè)DSB，靶向整合可以通過多種策略來實(shí)現(xiàn)，包括同源重組（HR）、微同源臂介導(dǎo)的末端接合（MMEJ）或者非同源末端接合（NHEJ）。
　　常用的同源重組（HR）策略介導(dǎo)的基因靶向整合在動(dòng)物胚胎和組織中效率低下。而且NHEJ介導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)方向的整合，以及在接合處引入各種形式的插入、刪除或突變，使得這種方法難以通過同框整合的方式形成內(nèi)外源融合基因以形成嵌合蛋白。即使是之前報(bào)道的MMEJ策略，也只能在某些系統(tǒng)內(nèi)提高效率。因此，學(xué)習(xí)者們?cè)噲D探究是否存在一種在多個(gè)系統(tǒng)內(nèi)都可以有更高效的編輯效率和更好的精確度的基因靶向整合策略。
　　在本工作中，學(xué)習(xí)團(tuán)隊(duì)基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了一種新的以HMEJ為基礎(chǔ)的靶向精確整合策略，即利用帶有單個(gè)向?qū)NA（sgRNA）靶向位點(diǎn)和長(zhǎng)同源臂（約800bp）的供體載體來實(shí)現(xiàn)高效的精確整合。
　　為了驗(yàn)證這一想法，學(xué)習(xí)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了四種類型的供體載體來比較敲入效率：HMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在800bp長(zhǎng)度的同源臂兩端）、HR供體（只有800bp長(zhǎng)度的同源臂）、NHEJ供體（只有sgRNA靶向位置序列）以及MMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在20bp的微同源臂兩端）（圖A）。然后將這四種系統(tǒng)分別在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系、小鼠和猴胚胎以及成體組織上進(jìn)行效率比較。
　　學(xué)習(xí)者發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞和N2a細(xì)胞中，HMEJ為基礎(chǔ)的定向整合效率與HR方法相比較并無顯著提高。然而，在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展現(xiàn)了非常強(qiáng)大的基因敲入能力（圖B）。此外，通過尾靜脈水動(dòng)力注射法感染成體小鼠的肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HMEJ介導(dǎo)的基因敲入效率遠(yuǎn)高于以HR、NHEJ和MMEJ為基礎(chǔ)的策略（圖CD）。采用AAV定點(diǎn)注射感染小鼠的視皮層區(qū)（V1），結(jié)果顯示HMEJ介導(dǎo)的在成體非分裂的成熟神經(jīng)元中靶向整合效率可以達(dá)到50%左右（圖EF）。最后，學(xué)習(xí)者對(duì)HMEJ介導(dǎo)的基因靶向整合的機(jī)制進(jìn)行了探討（圖G）。
　　該工作建立了一種新的基于HMEJ的靶向精確整合策略，即利用帶有單個(gè)向?qū)NA（sgRNA）靶向位點(diǎn)和長(zhǎng)同源臂（約800bp）的供體載體來實(shí)現(xiàn)高效的精確整合。HMEJ介導(dǎo)的基因敲入方法擁有更高效的編輯效率和更好的精確度，為包括基因編輯動(dòng)物模型的建立和疾病的靶向基因治療等應(yīng)用提供了非常大的前景。
　　該項(xiàng)工作由博士學(xué)習(xí)生姚璇、王興、劉真與學(xué)習(xí)實(shí)習(xí)員胡新德在靈長(zhǎng)類疾病模型學(xué)習(xí)組學(xué)習(xí)員楊輝、基因編輯平臺(tái)主任施霖宇與蘇州非人靈長(zhǎng)類學(xué)習(xí)平臺(tái)主任孫強(qiáng)的指導(dǎo)下完成，課題組的其他成員積極參與，并得到了神經(jīng)所學(xué)習(xí)員程樂平、上�？萍即髮W(xué)學(xué)習(xí)員黃鵬羽的大力協(xié)助，是眾多課題組通力合作的重要成果。該工作得到中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDB02050007 XDA01010409)，國家高科技研發(fā)項(xiàng)目(863項(xiàng)目;2015AA020307)，國家自然科學(xué)基金會(huì)(國家自然科學(xué)基金委資助號(hào)31522037和31500825)，中國青年千人計(jì)劃(楊輝)，中科院重大突破項(xiàng)目、國家關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目(2014BAI03B00 孫強(qiáng))，上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目 (16JC1420202 楊輝; 14140900100 孫強(qiáng))，中科院百人計(jì)劃(孫強(qiáng))等項(xiàng)目的資助。
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　　圖注：（A）HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ介導(dǎo)基因敲入的示意圖。HAL/HAR，左/右同源臂。三角形，sgRNA靶向位點(diǎn)。（B）在囊胚階段，HMEJ介導(dǎo)的基因編輯后的小鼠以及猴胚胎的代表性熒光圖片。插入圖，高放大倍數(shù)圖。（C）尾靜脈注射后第7天，肝切片中具有代表性的肝細(xì)胞的熒光圖。標(biāo)尺，50μm。GFP，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。（D）通過統(tǒng)計(jì)在GFP陽性細(xì)胞中mCherry陽性細(xì)胞比例來說明相對(duì)敲入效率。肝細(xì)胞在注射后7天進(jìn)行收集分離。數(shù)據(jù)點(diǎn)用黑點(diǎn)表示。***P0.001，不配對(duì)T檢驗(yàn)。（E）HMEJ-AAV注射后大腦切片中具有代表性的神經(jīng)元熒光圖。插入圖，高放大倍數(shù)圖。標(biāo)尺，100μm。（F）通過分別統(tǒng)計(jì)在GFP陽性細(xì)胞或所有DAPI陽性細(xì)胞中的mCherry陽性細(xì)胞的比例來說明相對(duì)或絕對(duì)敲入效率。每張大腦切片中至少統(tǒng)計(jì)2000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)動(dòng)物中至少統(tǒng)計(jì)三張大腦切片。輸入的數(shù)據(jù)點(diǎn)用黑色點(diǎn)表示。（G）HMEJ介導(dǎo)的基因敲入的示意圖。上海生科院等設(shè)計(jì)出高效精確基因靶向整合的新策略  |  責(zé)任編輯：蟲子
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