芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不 會(huì)失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細(xì) 菌會(huì)失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過 進(jìn)一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽 孢桿菌。
分離步驟
（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的 肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶 回實(shí)驗(yàn)室分離。
（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯 蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個(gè)平板。
（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有 45ml水的三角瓶中，搖動(dòng)片刻，然后將此 瓶用小火加熱至懸濁液沸騰，維持15min。 而后靜止5min，吸取上層液0.1ml加入到含 有4.5ml無菌水的試管中，制成1:100濃度的 懸液，然后吸取土壤懸濁液0.2ml滴加到牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻 涂布，并將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)1-2 天。
（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分 別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白 胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀， 具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì) 地、透明度等均一致） 生理生化鑒定 ? 一 過氧化氫酶測(cè)定 將測(cè)試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上， 培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴 3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過 氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出 現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。
二 需氧性試驗(yàn) ? 原理：不同種類的芽孢桿菌對(duì)氧氣的需求 性常有差異，因此本實(shí)驗(yàn)可作為鑒定芽孢 桿菌的一個(gè)較重要指標(biāo)。
操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中， 一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌 在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線 上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌
乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)
原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化 為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可 被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生 成紅色化合物，即表示試驗(yàn)陽性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以 補(bǔ)充胍基，可加速反應(yīng)。 培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸餾水 1000ml。調(diào)節(jié) PH 6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌 步驟： 將芽孢桿菌測(cè)試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培 養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量 肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色， 即為試驗(yàn)陽性。 ? ? ? ? 四 淀粉水解 原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀 粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝 于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。 步驟： 將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點(diǎn)種于平板上 （每皿點(diǎn)種2點(diǎn)），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形 成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平 板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀 粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。 ? 經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純 種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨 斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用 發(fā)酵條件的優(yōu)化 ? 將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培 養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于 100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng) 24h作為種子菌。 ? 發(fā)酵過程中采用單因素試驗(yàn)方法,考察 不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、 36℃)、培養(yǎng)時(shí)間(26、32、38、44、50、 80h)、接種量 (1%、2%、3%、5%、10%)、 初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy 培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、 Landy修飾 培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基)對(duì)脂 肽類抗生素產(chǎn)量的影響。
結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基, 初始pH7· 0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃, 發(fā)酵時(shí)間38h。
脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法
培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上 清，加 HCl調(diào)節(jié)pH為5· 0、4· 5、4· 0、3· 5、 3· 0、2· 5、2· 0,7000r/min離心10min,收集沉 淀。將沉淀在60℃ 的烘箱中干燥18h,稱重 即為脂肽類抗生素粗提物的干重。比較不 同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂 肽類抗生素所需的最佳pH值。 脂肽類抗生素的HPLC定量檢測(cè) ? 將脂肽類抗生素粗提物過Sephadex LH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥 后,加入0· 2ml乙醇溶解。對(duì)每管乙醇溶液進(jìn) 行平板抑菌試驗(yàn),試驗(yàn)真菌為油菜菌核病菌, 將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離 心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類抗生素的干重。 |
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