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科研入門之手把手教你做細胞免疫熒光

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科研入門之手把手教你做細胞免疫熒光

摘要: 　　小編最近在做細胞免疫熒光實驗，也是磕磕碰碰遇到了好多問題，參考了網上相關資料，再結合自身實際情況，現在總結出如下簡單明了的實驗protocol，分享給大家�！　∈紫戎v一下原理：免疫熒光技術（Immunofluoresc ...

　　小編最近在做細胞免疫熒光實驗，也是磕磕碰碰遇到了好多問題，參考了網上相關資料，再結合自身實際情況，現在總結出如下簡單明了的實驗protocol，分享給大家。

　　首先講一下原理：免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

　　正式進入操作步驟：
　　1.細胞鋪板：將細胞以合適的密度（注意：一般情況下，細胞密度不要太高，不要疊在一起，否則干擾最后拍片）接種于玻底培養(yǎng)皿（b小編用的是confocal皿：如下圖）中，進行轉染，加藥誘導等實驗處理。

　　2.固定：吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次。3min/次。加4%的多聚甲醛(用1X的PBS稀釋配制)，室溫固定20-30min。PBS清洗3次，3-5min/次。吸干PBS。
　　3.通透：加0.3%-0.5%Triton X-100(用1X的PBS稀釋配制)，室溫通透20-30min（如果是檢測細胞膜上表達的抗原，則省略此步驟）。PBS清洗3次，3-5min/次。吸干PBS。
　　4.封閉：在玻底培養(yǎng)皿中滴加正常血清或5%BSA封閉液，室溫封閉30-60min；
　　5.孵育一抗：吸掉封閉液，不用PBS洗，在每個玻底培養(yǎng)皿中滴加足夠量的稀釋好的一抗，并放入濕盒，4℃孵育過夜；
　　注意：一般抗體稀釋比約為1:50-1:100。正常玻底皿培養(yǎng)皿每皿加50-100ml抗體稀釋液（至少要能恰好浸沒住底部細胞）。還有必須保證濕盒有水，以免干片。一抗建議回收，放-20℃或-80℃保存。若是檢測多個指標，所用一抗必須是不同來源。
　　6.孵育二抗：回收一抗，加0.1%的PBST 清洗3次，3-5min/次。吸干PBST。滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次3min。
　　注意：該步驟及之后步驟都需要避光操作。二抗稀釋倍數約為1:100-1:200。
　　7.復染核：滴加DAPI或Hochest孵育5-10min（避光操作），對樣品進行染核，PBST 浸洗4次，每次5min。
　　8.拍片：在共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
科研入門之手把手教你做細胞免疫熒光  |  責任編輯：蟲子
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